第一百零七期 抗體純化用填料---- Toyopearl NH2-750F
陰離子交換填料Toyopearl ?NH2-750F通過流穿模式能有效去除多聚體及其他雜質(zhì)！
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前言
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抗體藥物純化工藝中最關(guān)鍵的第一步使用Protein
A填料進行親和分離。通過這一步，抗體純度可達到95%左右。但作為抗體藥物，純度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要進行進一步純化。主要雜質(zhì)包含多聚體、抗體片段，來自宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)（HCP）和DNA、病毒、以及自Protein A填料脫落下來的Protein A配基。這些雜質(zhì)可以通過陰離子交換填料和陽離子交換填料（或混合模式填料）或疏水填料去除。最近，抗體純化工藝中流穿模式（FT；原理：目標(biāo)抗體單體流穿，多聚體以及其他雜質(zhì)吸附）正在成為主流。其中，Toyopearl NH2-750F填料能夠在流穿模式下有效去除多聚體，病毒以及內(nèi)毒素等雜質(zhì)。
高載量?耐鹽型陰離子交換填料Toyopearl
NH2-750F的產(chǎn)品特性
流穿模式純化抗體（1）
?純化條件
層析柱：TOYOPEARL NH2-750F，
6.6 mm ID × 5.85 cm (2.0 mL)
流動相：10 mmol/L Tris-HCl ?(pH 7.0), ?0.25 mol/L NaCl
CIP; 1 mol/L NaCl? 溶液（洗脫多聚體以及其他雜質(zhì)）
流??? 速：300 cm/hr
檢??? 測：UV（280 nm）
溫??? 度：室溫
樣??? 品：酸處理后的單抗（1 mg/mL）
# 流穿條件：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0），0.25 mol/L NaCl，多聚體從28%降低到0%。（回收率75%）
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流穿模式純化抗體（2）
TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F填料純化后收集的組分，在第二步使用TOYOPEARL NH2-750F填料，通過流穿模式有效去除了多聚體、HCP、DNA和脫落Protein A配基等雜質(zhì)。
MCC Process | 條件 | 單體 回收率(%) | 多聚體 (%)* | HCP Log Red. | DNA (pg/mg) | Protein A (ppm) |
TOYOPEARL NH2-750F （流穿模式） | Starting material ?** | N/A | 3.1 | 1.7 | 0.3 | <0.05 |
條件A | 95 | 2.6 | 2.3 | not detected*** | <0.05 | |
條件B | 88 | 1.0 | 2.5 | not detected*** | <0.05 |
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* Aggregate determined according to Bond et al.
** Starting material; TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F填料純化后收集的組分。
*** Less than the lower limit of quantification using resDNASEQ Quantitative CHO DNA Kit (Life Tech).
參考文獻：Multi-Column Continuous
Chromatography for Protein A Capture and Orthogonal Polishing of Monoclonal
Antibodies, A. Grabski et al., PREP 2016, Poster, presentation data.
?TOYOPEARL NH2-750F的優(yōu)勢
● 填料孔徑大，可以有效去除多聚體、內(nèi)毒素、病毒等大分子雜質(zhì)。
● 耐堿性優(yōu)秀，可用0.1-0.5N NaOH溶液進行清洗，并且可重復(fù)使用。
● 病毒去除效果：以Log reduction表示，降低4～6個數(shù)量級。
● 作為耐鹽型（salt-tolerant）離子交換填料，即使樣品溶液中的鹽濃度高，也可以實現(xiàn)高載量吸附。
● 具備1 mL和5 mL規(guī)格的填料篩選用預(yù)裝柱。
● 還有TOYOPEARL
Sulfate-650F，TOYOPEARL
Hexyl-650C和TOYOPEARL
MX-Trp-650M等優(yōu)秀的抗體純化用填料，可實現(xiàn)更高純度的抗體純化效果。
?TOYOPEARL NH2-750F的產(chǎn)品特性
項目 | 規(guī)格 |
官能團 | 一級氨基 |
離子交換容量 (meq./L) | 0.07 – 0.13 |
粒徑 (um) | 30 – 60 |
靜態(tài)吸附載量 (IgG, g/L) | ≧ 70 |
菌體數(shù) (CFU/mL) | ≦ 100 |
內(nèi)毒素 (EU/mL) | ≦10 |
異物 | ≦ 6 |
溶出物 | ≦ 0.2 % |
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? ? 流穿模式純化條件（例）
? ? 流動相：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0-8.0）
? ? 流動相鹽濃度：0 - 500 mmol/L NaCl
? ??抗體上樣量參考值：50 g/L-gel
? ? 根據(jù)抗體的不同性質(zhì)，需要適當(dāng)調(diào)節(jié)或優(yōu)化pH和鹽濃度
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TOYOPEARL NH2-750F填料以及篩選用預(yù)裝柱產(chǎn)品一覽表
貨號 | 產(chǎn)品名 |
| 吸附載量（g/L） | 粒徑 (μm) | 包裝 (mL) | 備注 |
0023439 | TOYOPEARL NH2-750F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 1 mL × 6 | 篩選用預(yù)裝柱；需要同時使用ToyoScreen Holder（柱套） |
0023444 | ToyoScreen NH2-750F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 5 mL | 預(yù)裝柱：8 mm ID ×10 cm |
0021400 | ToyoScreen Holder | - | - | - | - | 預(yù)裝柱配套用柱套 |
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TOYOPEARL NH2-750F填料去除多聚體相關(guān)論文和海報
1. Salt tolerant chromatography provides salt tolerance and a better selectivity for protein monomer separations, N. Yoshimoto et al., Biotechnol. J., 10 (2015) 1.
2.Multi-Column Continuous Chromatography for Protein A Capture and Orthogonal Polishing of Monoclonal Antibodies, A. Grabski et al., PREP 2016, Poster presentation.
3.IgG Purification, Better, Faster, Cheaper, P. Gagnon et al., Bioprocess Inernational Conference, 2016, Poster presentation.
4. Purification of monoclonal antibodyies entirely flow-through mode, T. Yamada et al., J. Chromatogr., B 1061-1062 (2017) 110-116.
